... Biología Molecular ...


Discusión

El estadiaje de los sarcomas se basa en una valoración histopatológica macroscópica. Hay algunos valores pronósticos para el actual sistema de estadiaje por lo que hay que recurrir  a nuevos estudios para refinar el sistema de estadiaje por la definición de la biología molecular. El entendimiento de las anormalidades genéticas de los sarcomas favorecerá un tratamiento más efectivo para los pacientes de alto riesgo.

El cáncer, en general, no se puede atribuir a la mutación de un determinado gen, sin embargo, a nivel celular, se podría decir que es una enfermedad genética. 

Los genes son partes de la molécula de ácido desoxiribonucleico de los cromosomas que codifican las secuencias de aminoácidos de un polipéptido o proteína. Todas las células del cuerpo poseen el mismo número de cromosomas y, por tanto de genes. Estos genes poseen un programa que controla el crecimiento y la diferenciación celular. Si en este programa se produce alguna alteración, surge una proliferación incontrolada de células de un órgano o sistema determinado. Para que un cáncer se desarrolle hace falta que se produzcan secuencias de varias mutaciones genéticas. Estas mutaciones solo se encuentran en las células cancerosas y no en el resto del organismo. Casi todos los cánceres son monoclonales a nivel celular, es decir que proceden de una única célula precursora, lo que va en favor de la naturaleza genética del cáncer.

Presumiblemente en las anormalidades genéticas subyacen todos los estados neoplásicos. A grandes rasgos, los genes que controlan el crecimiento y la diferenciación se dividen en tres tipos: genes supresores del tumor, oncogenes y los genes de reparación del DNA. Los genes supresores inhiben  a la célula de experimentar una división incontrolada. Una mutación en un gen supresor puede abolir el mecanismo regulador del crecimiento. Sin embargo un oncogén estimula el crecimiento y la división celular. Los llamados genes de reparación del ADN codifican proteínas responsables de reparar las alteraciones del ADN; su mal funcionamiento o mutación provoca que las mutaciones que se producen en todos los genes, incluidos los oncogenes y los genes supresores, no sean adecuadamente corregidas y se acumulen rápidamente. En realidad, las interacciones y defectos moleculares son mucho más complicadas que lo descrito. Hay múltiples estratos de interacción y regulación de los genes y numerosas posibilidades de expresión anormal de los genes. Estos mecanismos incluyen mutaciones genéticas, delecciones y redistribuciones. Las mutaciones que regulan la actividad de los genes supresores y oncogenes pueden dar resultados similares. Una dificultad es que generalmente los tumores tienen múltiples anormalidades genéticas. Mientras que en algunos tumores, tales como el cáncer de colon, es posible seguir la progresión de las anormalidades genéticas entre un pólipo premaligno y un cáncer invasivo, esto no es posible para el sarcoma. Además hay múltiples anormalidades genéticas en tumores de alto grado. Esto no siempre aclara si las mutaciones genéticas son el defecto primario o el defecto secundario.  

Translocación cromosómica  

Un último mecanismo de activación es la existencia de una translocación cromosómica. Cuando un proto-oncogén se localiza en alguno de los puntos de rotura de una translocación entre cromosomas, ésta puede provocar la activación de aquél. El primer ejemplo que se conoció fue el linfoma de Burkitt, en el que estudios citogenéticos habían demostrado la existencia de una translocación entre los cromosomas 8 y 14 en gran proporción de casos. Con la llegada de las técnicas de localización génica a mediados de los 80 se realizaron dos descubrimientos independientes, pero que fueron críticos en el desarrollo de la oncogenética: que el locus cromosómico del proto-oncogén MYC estaba en la región 8q24 y que el locus de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas estaba en la región 14q32. Dichas regiones resultaron ser las mismas implicadas en la translocación del linfoma de Burkitt. Posteriores estudios demostraron que los puntos de rotura se situaban dentro o cerca del locus del gen MYC en el cromosoma 8 y dentro del gen de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas en el cromosoma 14. La hipótesis es que el gen MYC es activado al situarse en la proximidad de un gen que es transcrito activamente en los linfocitos B, dando lugar a una transformación linfomatosa de los mismos.

Las radiaciones han sido implicadas en la formación de sarcomas. Es sabido que la radiación causa roturas del DNA que pueden resultar en una translocación cromosómica y posible transformación maligna. En la tabla I encontramos unas translocaciones cromosómicas que han sido documentadas en un gran número de sarcomas. Como se puede ver, las translocaciones cromosómicas son eventos frecuentes, ocurriendo en más del 95% de algunos sarcomas. Estas translocaciones cromosómicas permiten que algunos genes, particularmente los oncogenes, sean traídos a la proximidad de diferentes genes promotores. La fusión de un gen que normalmente se manifiesta con un oncogén que normalmente no se manifiesta, da como resultado la manifestación impropia del oncogén, porque se vuelve inactivo, bajo el mando del promotor del gen normal. La activación de los oncogenes resulta en un incremento de crecimiento y transformación maligna de las células. Tal es el caso bcr/abl en la leucemia mieloide crónica y bcl-2 en el linfoma de Hodgkin de células B.

El rabdomiosarcoma alveolar tiene una translocación cromosómica característica entre el brazo largo del cromosoma 2 y el brazo largo del cromosoma 13, referido como t(2;13) (q35 ;q14). Esta translocación localizada en el gen PAX3 (que está implicada en la regulación transcripcional de la evolución neuromuscular) en proximidad al a gen AVL. Cuando se encuentra una translocación consistente en un tipo de tumor, es presumible que los genes afectados por la translocación sean implicados en la patobiología del tumor. Esto generalmente es corroborado por un análisis funcional de los genes afectados que son inactivados por la translocación,  en cuyo caso el gen es un gen supresor del tumor, o activado por la mutación como antes.  

El sarcoma de Ewing tiene una translocación entre los cromosomas 11 y 22 en el 95% de los casos que afecta al mismo punto de ruptura, como se ha postulado ampliamente, que un gen en esta localización es responsable de la evolución del sarcoma de Ewing . La translocación produce una fusión de proteínas entre los genes EWS y Fli-1. El último es un miembro de la familia de los factores de transcripción ets. El descubrimiento de EWS/Fli-1 ha ayudado a ordenar la clasificación general de tumores de células pequeñas redondas, que se incluyen en PNET (periperal primitive neuroectodermal tumor), sarcomas de Ewing, y tumor de Askin, porque muchos comparten el hecho común de fusión de EWS con un factor de transcripción.  

Genes supresores del tumor  

Los dos genes supresores de tumor más bien estudiados son el del retinoblastoma (Rb) y el gen p53. El gen Rb fue el primero en descubrirse. La hipótesis inicial del efecto tumor supresor fue basada en la diferencia en la epidemiología entre retinoblastoma hereditario y espontáneo. Las mutaciones en el gen Rb son la base de, virtualmente, todos los retinoblastomas. Los pacientes con retinoblastoma hereditario tienen riesgo de otras neoplasias, aproximadamente el 15% de estos pacientes desarrollan un tumor adicional, la mitad de ellos será un osteosarcoma. El análisis de una serie de pacientes con osteosarcoma sin retinoblastoma conocido reveló que el 35% tenían una mutación Rb.  

El gen Rb ha sido clonado y su función definida como un regulador de la proliferación celular. En un estado hipofosforilado, el Rb ata al ADN e impide la replicación celular. Cuando se convierte en estado fosforilado, no ata el ADN y las células se dividen. Muchos factores de crecimiento y citoquinas afectan el estado de fosforilización de Rb. Las mutaciones en los genes Rb los inactiva y en algunos ambientes permite la proliferación incontrolada y la evolución. El Rb es un gen supresores recesivo porque ambas copias de los genes deben estar mutadas para perder su actividad supresora. Así, con tal que una copia de gen sea normal, será suficiente actividad en la proteína anormal para regular eficazmente la célula porque no hay interacción entre el tipo desordenado y la proteína Rb mutante.  

El gen tumor supresor mutado más común en cánceres humanos es el gen en p53, que esta mutado en aproximadamente el 50% de todos los tumores. El síndrome de Li-Fraumeni es un defecto heredado en estos genes tumor supresores. Una interpretación postulada para el p53 es que detiene el ciclo celular cuando hay ADN dañando para que la célula pueda repararse así misma antes de la división. Las células carentes de función normal del p53 continúan dividiéndose antes que el ADN dañado puede ser reparado y se convierta en una mutación potencialmente tumorígena. El gen p53 puede suprimir también la transcripción de otros genes de crecimiento relacionados, tales como c-fos y c-jun. Estos se llaman genes supresores dominantes porque una mutación en una copia del gen es capaz de inactivar la proteína normal desordenada. La proteína mutada se ata al tipo de proteína desordenada y el compuesto se convierte en inactivo. Se encontró que el 28% de 65% de osteosarcomas tenían mutaciones de p53. Sólo unos pocos pacientes con osteosarcoma tenían una nueva línea germinal de mutación en p53 (una mutación afecta a todas las células del individuo) la mitad de las mutaciones somáticas (mutaciones sólo en las células del tumor) son mutaciones puntuales y otras son de distribuciones o delecciones.  

El gen murine double minute-2 (MDM2) inhibe el p53 por combinación al p53. Por esta razón impide que el p53 se combine al ADN. Cuando el DMD2 esta hiperexpresado, el p53 es inactivado. La hiperexpresión de DMD2 por amplificación de un gen se ha visto que ocurre en un 37% en los sarcomas de los tejidos blandos,10% de osteosarcomas, y 13% de sarcoma de Ewing, pero no en el condrosarcoma.  

Indudablemente, todavía quedan por descubrir mutaciones de genes supresores de tumor que son responsables de que los tumores con la expresión Rb , p53, y MDM2 sean normales. Aunque las mutaciones de los genes supresor ocurren en sarcomas, este conocimiento no se ha trasladado al uso terapéutico. En cultivos de células, el gen normal se puede insertar a una célula y la función normal Rb o p53 restaurada. Con los avances en la terapia genética, esperamos que el futuro tratamiento será capaz de restaurar el mecanismo regulador del crecimiento anormal de los pacientes.  

Oncogenes 

Nuestras células no tienen, normalmente células inductoras del cáncer. Los oncogenes son, en realidad, formas mutadas de genes estimuladores normales (proto-oncogenes). Es al mutar estos, y originar proteínas con función alterada que estimulan el crecimiento o la invasividad celular, cuando se convierten en oncogenes. Es decir, la mutación tiene como consecuencia un exceso de función del gen que empieza a producir señales ininterrumpidas que obligan a la célula a dividirse. Ocurre en un alelo de una célula somática, y es dominante respecto del alelo normal. Toda la progenie derivada de esta célula iniciará una transformación tumoral. El tumor así originado es monoclonal y esporádico. El término proto-oncogenes se debe reservar a los genes normales, y el de oncogenes a las formas mutadas de los mismos. Los proto-oncogenes necesitan ser "activados", es decir modificados por virus, radiación o sustancias químicas. Los mecanismos de activación conocidos son:

  1. Mutaciones puntuales de la secuencia de ADN en un punto preciso del proto-oncogén.

  2. Amplificación, que da lugar a una sobre-expresión de la proteína que produce. 

  3. En ocasiones la amplificación ocurre directamente en el ADN que constituye el propio proto-oncogén, formando múltiples copias de un proto-oncogén y a menudo incluyendo a otros genes próximos al encogen. Se ha demostrado que la formación de múltiples copias de un oncogén (de la familia erb) está relacionado con el grado de agresividad del cáncer de mama.

  4. Transducción. Un virus ARN "rapta" un proto-oncogén incorporado a su genoma. El pro-virus se inserta cerca del proto-oncogén; se produce la co-transcripción de la secuencia del proto-oncogén y de la secuencia viral. El proto-oncogén transducido se comprota anormalmente cuando es reintroducido al genoma de otra célula y constituye un oncogén activado.

  5. Mutagénesis insercional. En este caso las células son infectadas por virus que tienen un gen promotor, este gen se inserta en la proximidad de un proto-oncogén, provocando su alteración y convirtiéndose en un oncogén.

  6. "Cromosoma Philadelphia", consistente en una translocación entre los cromosomas 9 y 22, dando lugar a una construcción génica quimérica que parece tener un papel fundamental en la patogénesis de la leucemia mieloide crónica. La translocación une un proto-oncogén denominado ABL, localizado en la región 9q34 y el gen BCR en 22q11. La proteína resultante mantiene la actividad protein-quinasa del gen ABL, aunque ésta es alterada por la proximidad física del gen BCR. Posteriormente, han ido siendo identificadas otras translocaciones asociadas a malignopatías hematológicas. El cromosoma Philadelphia, cuya identificación se utiliza con fines diagnósticos, corresponde al cromosoma 22 pequeño.

  7. Redistribución cromosómica. Por ejemplo, translocaciones: en el linfoma de Burkitt el gen c-myc del cromosoma 8 se inserta en el cromosoma 14, cerca del locus que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina, con la consiguiente excesiva expresión del gen c-myc.

Se ha comprobado que un oncogén no es capaz de transformar todos los tipos de líneas celulares con las que se pone en contacto. En estos casos, cuando se combinan dos oncogenes se produce la transformación maligna de las células primarias. Este hallazgo hizo sospechar que en los experimentos iniciales las células de ratón utilizadas no eran completamente normales. Esta fue la primera evidencia de que el desarrollo de un tumor maligno precisa de dos o más fenómenos transformantes.

En el hombre y en otras especies se han identificado más de 50 genes cuya función está relacionada con los complejos sistemas de señales que regulan el crecimiento, proliferación y división de las células. Estos genes son los proto-oncogenes, identificados a través de su forma activada (oncogenes) o tras su activación por fenómenos de amplificación del ADN o por translocaciones cromosómicas.

Se han descrito unos 50 oncogenes. Alguno de ellos evaluados en sarcomas. En una serie de 26 sarcomas analizados con la técnica de Southern blot, solo 3 tumores tenían  amplificación  o redistribución. El Erb-2 (HER-2/neu) es una versión truncada del factor de crecimiento receptor epidérmico que tiene alta actividad de autofosforilización intrínseca proteinkinasa. La amplificación de erb-2 se ha sugerido como responsable de un pronóstico pobre en algunos tipos de cáncer de mama. El papel que juega el erb-2 en los sarcomas de tejidos blandos está definida claramente. En un estudio de la expresión erb-2 en sarcoma no se encontró una sobreexpresión en 87 sarcomas de tejidos blandos o 45 sarcomas óseos. En otro estudio 2 de 6 tumores benignos de tejidos blandos y 6 de 105 sarcomas tenían amplificación de c-erb-B-2 y un 37% de incremento del ácido ribonucleico mensajero (mARN). No hubo correlación entre la amplificación del gen erb-B-2 o el nivel  de mARN con la expresión de proteínas de bajo grado  histológico. Esto indica que un análisis completo de cada oncogén debe incluir Southern blot para la amplificación del gen y Western blot, para evaluar la expresión de proteína resultante de los cambios de traslación si hay alteración en el ADN o ARN.  

CAMBIOS EN COMPONENTES REGULATORIOS DEL SISTEMA ADHESIVO. CINASA DE ADHESIÓN FOCAL
Una de las moléculas más importantes en la señalización mediada por integrinas, es la cinasa de adhesión focal (FAK). La p125 FAK es una tirosina-cinasa intracelular, que se une a la subunidad b de las integrinas. La unión a ligando y la agregación de integrinas en los sitios de adhesión focal, provoca un cambio conformacional en el dominio citoplasmático de la subunidad b, que induce la activación de FAK. Una vez activa, FAK se autofosforila generando un sitio de enlace de alta afinidad para la tirosina-cinasa c-Scr. FAK es sustrato para c-Src, por lo que el reclutamiento y activación de esta cinasa, aumenta el grado de fosforilación en FAK y genera nuevos sitios para interacciones con proteínas del citoesqueleto. Tiene otros sitios de interacción proteína-proteína que no requieren de fosforilaciones, prolinas, a las que pueden unirse proteínas que contienen dominios SH3.

El papel de FAK en la progresión de neoplasias no se ha aclarado por completo, pero hay datos que indican que puede modificar la adhesión, proliferación y la movilidad celular; por ejemplo, se ha reportado que las células epiteliales transfectadas con FAK constitutivamente activa, se vuelven tumorigénicas y que FAK se sobreexpresa en tejido metastásico humano. Esta cinasa también participa en la regulación de los procesos de supervivencia; la reducción de los niveles de FAK mediante sondas antisentido induce el desprendimiento y la apoptosis en varias líneas tumorales. FAK se encuentra constitutivamente activa en diferentes líneas celulares de carcinoma pulmonar; in vivo, aproximadamente 45% de las neoplasias pulmonares presentan niveles de fosforilación de FAK aumentados. Los sujetos positivos para FAK activa tienen un tiempo de sobrevida más corto que los casos negativos. Agochiya encontró que el numero de copias del gen fak (codificado en el cromosoma ocho) se encuentra incrementado en líneas celulares derivadas de carcinomas pulmonares. El consecuente aumento en la expresión de FAK correlaciona con la adquisición de un fenotipo invasivo. Se han encontrado por Western blot una aumento de p125FAK  en los trece sarcomas cuando se compararon al tejido normal o lesiones hiperplásicas, sugiriendo que p125FAK puede estar relacionado con la invasión y las metástasis.  
 

BIBLIOGRAFÍA

Schroder A, Delling G, Kaiser EA.:Expression analysis of protein tyrosine kinases of the FAK (focal adhesion kinase) family in osteosarcoma. Pathologe 2002 Sep;23(5):361-6

La transformación maligna generalmente es el resultado final de los genes de tumor supresores y oncogenes. Dado el número total de genes que se han visto relacionados en la tumorigénesis, y la naturaleza de la intensiva labor para testificar tumores para cada anormalidad genética, la relativa contribución de cada gen para desarrollar tumor que es generalmente ambiguo, no hay ningún método para evaluar la expresión cuantitativamente y simultáneamente de un gran número de genes en un tejido que pueda permitir un análisis más completo de anormalidades en expresión genética en tumores.    

Tabla I: Aberraciones citogenéticas características en tumores malignos del hueso y de los tejidos blandos

Histología  

Eventos citogenéticos característicos  

Frecuencia %  

 

Sarcoma de Ewing  

t(11;22)(g24;q11.2-12)  

95  

Proteína de fusión EWS/Fli-1, que es un factor de transcripción  

Rabdomiosarcoma alveolar  

t(2;13)  

80  

Fusíón de PAX3 con ALV  

Rabdomiosarcoma embrionario

+2q, +20  

80  

 

Sarcoma sinovial  

t(X;18)  

95  

Fusión SSX con SYT  

Histiocitoma fibroso maligno  

complejo  

90  

 

Tumor maligno periférico de la vaina nerviosa  

Complejo  

90  

 

Leiomiosarcoma  

1p-  

75  

 

Fibrosarcoma infantil

+11,2 +17. +20  

90  

 

Dermatofibrosarcoma protuberans  

Ring chromosome 17  

90  

 

Liposarcoma mixoide  

T(12;16)  

75  

Fusión de CHOP con TLS que resulta en un factor transcriptor de ADN  

Liposarcoma pleomórfico  

Complejo  

90 

 

Liposarcoma bien diferenciado  

Ring chromosome 12  

80  

 

Sarcoma de células claras  

T(12;22)  

90  

Fusión EWS y AFT 1, resultando un factor transcriptor ADN  

Sarcoma estromal endometrial  

T(7;17)  

50  

 

Tumor desmoplástico de células pequeñas redondas intraabdominal  

T(11;22)(p13;q12)  

>50  

Fusión EWS y WT1, resultando un factor transcriptor de ADN  

mesotelioma  

1p-, 3p-. –22  

90  

 

Condrosarcoma mixoide  

T(9;22)  

50  

 

Exostosis hereditaria múltiple  

8q24.1, 11p13, 19q  

 

Mutaciones en EXT1, 2, o 3  

Adaptado de Fletcher JA: Cytogenetics and experimental models of sarcomas. Curr Opin Oncol 1994;6:367-371

 

Biología molecular aplicada a histopatología


Son un conjunto de técnicas basadas en la genética molecular y la bioquímica que permiten analizar fenómenos biológicos y patológicos a nivel molecular. Junto con la microscopia electrónica y la inmunohistoquímica ayudan a refinar el diagnóstico en Anatomía Patológica.

H ibridación in situ

R eacción en cadena de polimerasa (PCR)

I n situ-PCR

A nálisis de polimorfismo de fragmentos de restricción

Southern blot permite el análisis de ADN genómico o fragmentos definidos de ADN después de digestión con endonucleasas de restricción.

Northern blot permite estudiar ARN en forma análoga.

Western blot es una técnica inmunológica derivada , que se utiliza para analizar antígenos proteicos. Las proteínas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana sólida o membrana o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas.